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Department Chemie - Institute for Advanced Study
 
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Arbeitsgebiete
1. Diplom- und Doktorarbeit

In der Diplom- und Doktorarbeit arbeitete ich präparativ über die Kupfersalz-katalysierte Reaktion von Diazomethan mit Aromaten. Neu war damals, daß das Carben keine Einschiebungsprodukte (Methyl-Aromaten) lieferte, sondern ausschließlich die Addition an die Doppelbindung (Übersicht: 8). Problematisch war die Abtrennung der Homologisierungsprodukte vom Edukt, da die Gaschromatographie zur Dreiringöffnung zu Methylaromaten oder Benzocycloheptatrien (aus Benzonorcardien) führte. Erst durch den Trick, eine Chromatographie-Säule oder Dünnschichtplatte mit Pikrinsäure zur Hälfte zu belegen führte zum Erfolg, da die Norcaradiene schlechter Pikrate bilden (11).

2. Habilitation

Schon während der Dissertation fielen mir bei den NMR-Messungen Linienverbreiterungen auf. Dies führte dann zu systematischen Studien von innermolekularen Beweglichkeiten, wobei zur damaligen Zeit praktisch keine Kenntnisse über Rotationsbarrieren nahe der Trenngrenze existierten. Es gelang mir dann eine ganze Reihe von Rotationsbarrieren erstmalig zu bestimmen (Übersicht: 34).

Als Organiker ergriff ich die Möglichkeit, Mechanismen durch Substituenteneffekte zu untersuchen. Besonders interessierte mich der Mechanismus der syn-anti-Isomerisierung in Iminen. Da die Rotation mit einer Polarisierung der CN-Doppelbindung einhergeht, würden in Guanidinen, in denen die positive Ladung am Kohlenstoff am stärksten stabilisiert wird, eine Widerlegung des Rotationsmechanismus die Absicherung des Inversionsmechanismus in allen Iminen bedeuten. Der wohl klarste Beweis für den Inversionsmechanismus wurde schließlich durch stereochemische Korrelationen unter Ausnutzung prochiraler Sonden geliefert (52). Übersichten über Isomerisierungen um Doppelbindungen finden sich in 56 und 66.

3. Nichtpeptidische Arbeiten (frühe Frankfurter Zeit)

Ein anderes Arbeitsgebiet betraf die Messung der Barriere zwischen Ionenpaar und kovalenten Spezies. Der Trick bestand darin, daß Bedingungen gesucht werden, in denen beide Formen etwa zu gleichen Teilen koexistieren (das kann man durch geschickte Wahl der Stabilität der Anionen bzw. der Kationen, des Lösungsmittels und der Temperatur erreichen). Es gelang damit unerwartet hohe Ionen-Rekombinationsbarrieren z.B. von über 10 kcal/Mol am System Tritylchlorid/Triphenylchlormethan (84) und in Tropyliumsalzen zu messen. In einem Falle konnte der Beweis dafür erbracht werden, daß die Barriere zwischen Kontakionenpaar und kovalenter Spezies liegt (91). Eine Übersicht über diese leider von der Welt der mechanistisch orientierten Chemiker kaum wahrgenommenen Arbeiten findet sich in 110. Immerhin sind es die ersten und wohl immer noch einzigen experimentellen Barrieren von Ionenpaar-Rekombinationen.

Von Interesse ist auch die Isomerisierung in Tropyliumazid, das in unpolaren Lösungsmitteln eine 3,3-sigmatrope Verschiebung, in polaren Lösungsmitteln eine unselektive Verschiebung des Azidrestes über Ionen zeigt (96). Durch das Solvens läßt sich also hier ein kontinuierlicher Übergang von einer Orbital-kontrollierten Reaktion zur Ionenreaktion erzielen.

In substituierten Homotropilidenen, für die wir auch einen neuen Syntheseweg erschlossen haben, weist der Substituenteneffekt auf einen frühen Bindungsbruch zum überbrückten Bisallylsystem hin (80).

Einen gewissen Abschluß derartiger Arbeiten stellen die Publikationen Nr. 90 und 113 dar. In Nr. 90 haben wir drei verschiedene Prozesse (NH, OH-Austausch, Inversion des komplexierten Aminstickstoffes und Ligandenaustausch) nebeneinander nachweisen können. Die Publikation 113 entstand, weil bei der Diskussion von Raktionsabläufen in Lösung immer wieder gesagt wurde, daß das Konformationsproblem durch eine Röntgenstruktur gelöst sei. Dies schien mir unzulässig. Wir wählten daher zwei Beispiele, in denen die stabilste Konformation in Lösung durch eine Barriere von der Konformation im Kristall verschieden ist und verglichen die Röntgenstruktur und Festkörper-NMR-Spektren einerseits mit Lösungs-NMR-Spektren bei tiefer Temperatur und andererseits mit den Spektren der bei Raumtemperatur äquilibrierten Substanz. Damit konnten wir die Verschiedenheit der Kristallstruktur und der Struktur in Lösung eindeutig beweisen.

4. Cyclische Peptide

Etwa Mitte der 70er Jahre war inzwischen so viel über Rotations- und Inversionsbarrieren bekannt, daß wir uns auf der Suche nach einem neuen Arbeitsgebiet, das präparative organische Chemie mit NMR-spektroskopischer Konformationsanalyse verbindet, den Peptiden zuwandten. Zunächst waren es Modellpeptide wie Cyclotripeptide, deren konformatives Verhalten durch Zurückführen auf Cyclohexan (gemäß Dunitz-Waser: cis-Doppelbindung ist äquivalent einer CH2-Gruppe) mit Boot- und Sessel verstanden werden konnte (Übersicht: 103).

Bei der Beschäftigung mit den im allgemeinen sehr flexiblen Peptiden wurde bald klar, daß es unbedingt notwendig ist, die Konformation durch Cyclisierung(en) zu fixieren. Nur so kann man klare Aussagen über die Struktur erhalten. Cyclisierungen sind aber auch essentiell für das Ausloten der "bioaktiven Konformation", da man in einer rigiden Struktur nur im passenden Fall (matched case) Superaktivität erreicht. Konformationsfixierung in einer falschen Paßform (mismatched case) führt zu Inaktivität. Diese Ideen wurden 1982 in einer Übersicht erstmals dargelegt (119). Damit rückten cyclische Peptide aus dem Bereich von molekularen Exoten zu einem heutzutage generellen Syntheseziel in der medizinischen Chemie vor.

In der Folge synthetisierten wir verschiedene natürliche Cyclopeptide (Streptogramin B, 130; Virginiamycine, 153; Didemnin A und B, 196, 210; Antamanid, 205, 206; Hymenistatin, 296; Axinastatin, 340) aber vor allem Analoge hierzu für Struktur-Wirkungs-Beziehungen. Ziel der Untersuchungen waren möglichst kleine, superaktive Cyclopeptide, die hochselektiv wirken.

Erfolgreich waren wir unter anderem auf dem Gebiet der Cytoprotektion (Inhibierung der Cholat- und/oder Phalloidin-Aufnahme in Hepatozyten) (Übersicht: 189), Immunstimmulation durch cyclische Thymopoietine (vgl. 208) und kürzlich bei den Inhibitoren für das avß3-Integrin (258, 281 u.a.m.).

Gerade die letzteren Arbeiten, die derzeit zu einem bei E.Merck entwickelten Arzneimittel führen, sind von besonderem Interesse. Die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion ist bei vielen Prozessen (Tumor-Matastasierung, Angiogenese = gezieltes Wachstum von Blutgefäßen, Embryogenese, Thrombose, Osteoporose u.v.m.) von Bedeutung. Dabei erkennen die zellulären Rezeptoren (die Integrine) eine kleine Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp oder im Einbuchstabensymbol RGD. Unser Ansatz war, durch Cyclisierung Selektivität und Superaktivität zu erreichen. Dabei verwendeten wir ein neues Konzept des "räumlichen Screening": in cyclischen Penta- oder Hexapeptiden wird die Konformation überwiegend durch die Chiralität der Aminosäuren bestimmt. Dadurch kann man z.B. in einem Cyclopeptid der Sequenz RGDFV die RGD-Sequenz über ein definiertes Grundgerüst schieben, indem man jeweils eine der Aminosäuren in D-Konfiguration wählt. Bei diesem Screening fanden wir die bei weitem aktivste und selektive Inhibierung für avß3-Integrin, das bei der Krebsmetastasierung besonders wichtig ist. Inwischen haben wir von dieser Leitstruktur eine ganze Reihe von Peptidomimetika hergestellt, von denen einige Verbindungen biologisch sehr interessant sind. Die Inhibierung der Angiogenese durch unsere selektiven Peptide, die zur Apoptose (Zelltod von Tumorzellen) und Necrose humaner Tumoren führt, erregte weltweit Aufsehen.

5. Peptidomimetika, Zuckerchemie

Nach Herausarbeiten der für die biologischen Effekte notwendigen pharmakophoren Gruppen und vor allem deren räumliche Orientierung in Form von sterisch fixierten Cyclopeptiden gilt es, von der Peptidstruktur wieder fort zu kommen, da Peptide in der Regel weder oral gut aufgenommen werden, noch metabolische Stabilität (Ausnahme: kleine Cyclen) aufweisen. Daher synthetisieren wir nunmehr systematische Strukturvarianten in denen

- die Peptidbindung durch Elemente wie -CSNH-, -CO-CH2-, -CH2NH-, -CH(OH)NH- ersetzt werden,

- die Seitenketten durch Glycosylierung oder andere Modifikationen verändert sind und

- ganze Strukturelemente durch andere Teilstücke ersetzt werden.

Solche Variationen schließen auch ungewöhnliche (und damit enzymatisch) stabilere Verknüpfungen von Zucker und Peptiden ein. So synthetisierten wir in jüngster Zeit erstmals neuartige C- und S-Glycopeptid-Bausteine, die wir dann in biologisch aktive Peptide wie z.B. in den von Hoechst verkauften LHRH-Agonisten Buserilin (gegen Prostata-Carcinom) einbauten.

Vom Synthesestandpunkt ist es von Interesse, daß es uns gelang, das anomere Zentrum zum Anion umzupolen ohne daß Eliminierung zum Glycal erfolgte. Dies geschah durch den Trick, die 2-Hydroxylgruppe ungeschützt zu lassen und das Dianion herzustellen (299). Letzteres reagiert erwartungsgemäß stereospezifisch (d.h. ohne Inversion am C-1) mit verschiedenen Elektrophilen.

In letzter Zeit befassen wir uns auch mit Zucker-Aminosäuren (SAA). Das erste Derivat dieser Art wurde in 3 Stufen aus Glycose (Nitromethan, Reduktion der Nitrogruppe, Oxidation an C-6) hergestellt und kann als turn-Mimetikum aufgefaßt werden (318). Eine ganze Palette neuer SAAs ist in Arbeit. Damit kann man neuartige Polymere, neue struktur-induzierte Teilstücke in Peptiden und Skelette für kombinatorische Synthesen erstellen.

6. Konformationsbestimmung in Lösung und Design biologisch aktiver Verbindungen

Die Arbeiten zur Struktur und Dynamik durch NMR-Spektroskopie ziehen sich wie ein roter Faden durch unsere Arbeiten (vgl. hierzu den auf Einladung persönlich gefärbten Artikel "Dynamics by NMR" für die anläßlich des 50. Jahrestages der Entdeckung von NMR herausgegebenen historischen Band der Enzyklopädie NMR , Nr. 338).

Zahlreiche Strukturen von biologisch aktiven Cyclopeptiden wurden von uns erstmalig in Lösung bestimmt:

Cyclosporin (135, 136, 179, 236, 262) und Derivate (259), Aspilicin (160), Didemnine (196, 210, 225), Cinnamycin (203, 253), Antamanid (205, 206), Tendamistat (224), FK506 (235, 252), Phalloidin (237), Hinge Peptid aus Immunglobulin IgG1 (243), Substance P (249), Rapamycin (279), Hymenistatin (296), Cardiotoxin CTXI (314), Balhimycin (331), Axinastatin (340).

Dazu kamen zahlreiche synthetische Peptide, die für Konformations-Wirkungs-Beziehungen synthetisiert waren.

Die Konformationsanalyse wurde jeweils mit modernsten Techniken durchgeführt. Neben neuen NMR-Methoden (siehe nächster Abschnitt) wurden auch neue Rechenverfahren (zunächst in Zusammenarbeit mit van Gunsteren (jetzt ETH), später auch alleine) eingeführt. Die wichtigsten Neuerungen waren:

a) Die erstmalige gemeinsame Verwendung von DG und MD-Verfahren (190, mit Blaney und van Gunsteren)

b) Entdeckung von schnellen Konformationsgleichgewichten durch NOE und J-Kopplungen (192, mit van Gunsteren)

c) Entwicklung eines Kraftfeldes für das Lösungsmittel DMSO und Anwendung in MD-Rechnungen (245)

d) Beweis für Vakuumartefakte in MD-Rechnungen (243, 261)

e) Nutzung von J-Kopplungen in MD-Rechnungen (269, 275, 284, Übersicht: 329)

f) MD-Rechnungen mit zeitabhängigen J-restraints (280, mit van Gunsteren)

g) Dynamischer Zwang als Nachweis der induzierten Anpassung (264, 290)

h) Ensemble Rechnung zur Behandlung von schnellen Konformations-gleichgewichten (301)

i) Erstmalige Verwendung von Kopplungskonstanten in Ensemble Distance Driven Dynamics (305)

k) Verwendung von H-Brücken als restraints in MD (316)

l) Aufbau einer Zwei-Phasen-Box als Mimik für Membrane (Experimentelle und theoretische Studien zum Verhalten von flexiblen Molekülen an Flüssig-Flüssig-Phasengrenzflächen (311, 322)

Gegenwärtig interessieren wir uns für große Proteine, da hier noch ein relativ offenes Feld für die Weiterentwicklung von NMR-Techniken ist. So haben wir uns u.a. Domänen von PTS-Proteinen ausgewählt (zusammen mit B. Erni in Bern), die für den aktiven Transport und gleichzeitige Phosphorylierung von Zuckern in die Zellen verantwortlich sind. Wir untersuchen Proteine, von denen keine Röntgenstruktur existiert und die membranständig sind. Mit der homodimeren IIAMan-Domäne (Mol. Gew. 31 kDa mit 13C und 15N Markierung) haben wir gerade die Grobstruktur fertig. Es ist eines der größten oder das größte bisher mit NMR bearbeitete Protein.

An der IIBGlc-Domäne (Publ. in Vorbereitung) konnten wir auch das (instabile) phosphorylierte Protein messen und vor allem den instabilen Komplex mit der IIA-Domäne, in dem der Phosphatrest übertragen wird. Das ist meines Wissens der erste Protein-Protein-Komplex überhaupt, von dem eine NMR-Struktur existiert (Publ. in Arbeit).

7. Neue NMR-Techniken

Nach den bahnbrechenden Arbeiten von R.R. Ernst und K. Wüthrich wandten wir uns sehr bald den zweidimensionalen Techniken zu. Nach einer kurzen Einarbeitungszeit und gemeinsamen Arbeiten mit Ernst (129, 133, 174) waren wir in der Lage, durch eigene Entwicklungen zum Fortschritt dieses Gebietes beizutragen, von denen ich die wichtigsten hier aufzählen möchte:

a) Eine effiziente Technik zur Aufklärung heteronuclearer Weitbereichs-kopplungen (COLOC) (diese Arbeit wurde ein "citation" Bestseller) (137)

b) Kohlenstoff-Kohlenstoff-Relay-Techniken (146)

c) Die Verwendung von Differenzen und Summen in COSY-Spektren (DISCO) - ein neues Verfahren zur Bestimmung von J-Kopplungen (149)

d) Überführung von 2D in 1D-Techniken durch selektive Anregung (166). Diese viel zitierte Arbeit enthält praktisch die Idee der 3D-Spektroskopie (siehe 338).

e) Erstes gepulstes ROESY-Spektrum (174)

f) Relayed NOE-Experimente (195)

g) NOESY-TOCSY und ROESY-TOCSY (197, 204)

h) Verwendung von Halb-Gauß-Pulsen zur selektiven Anregung (211)

i) Erstmalige Verwendung von Intensitätsmessungen zur Bestimmung von Kopplungskonstanten (182)

h) Erste Verwendung von DEPT in der inversen heteronuclearen 2D-Spektroskopie (217, 219)

l) Erstmalige heteronucleare 3D-Spektroskopie (230, 233)

m) Eine neue effiziente Technik zur Messung heteronuclearer Weitbereichs-kopplungen (HETLOC) (251, 255)

n) Das HN(CA)N-Experiment (274), eine verbesserte Version des HNCA-J-Experimentes zur Messung von HNHa-Kopplungen in großen Proteinen (285). Damit können diese 3J-Kopplungen mit ca. 1-2 Hz Fehler noch bei Molekülen bestimmt werden, wenn die Linienbreite der a-Protonen ca. 50 Hz groß ist!

o) Das H(N)CACO-Experiment (285)

p) Eine neue und erstmals effiziente Technik zur Messung von Austauschraten der NH-Protonen in isotopen-angereicherten Proteinen (MEXICO) (304)

q) Weitere Experimente zur Bestimmung heteronuclearer Kopplungskonstanten (310)

r) 13C-editierte Doppelquanten-Spektroskopie (326)

s) Entwicklung von Techniken zur Vermeidung der Sättigung austauschender Protonen (sog. flip-back-Experimente). Diese Techniken sind für große Proteine essentiell und stellen eine große Verbesserung dar (327, 332)

t) Modifizierte NOESY-HSQC-Experimente (333, 346)

   
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